ATAC-seq analysis from FASTQ t…

# ATAC-seq 数据分析全流程方案（20个样本，PE150，参考基因组 hg38）

一、环境与工具准备

• 推荐：Conda 创建独立环境，安装 FastQC、Trim Galore/cutadapt、Bowtie2、SAMtools、Picard、BEDTools、MACS2、deepTools、ataqv
• 参考基因组：hg38（可下载 ENCODE 提供的 bw+index，排除 chrM 与黑名单区域）

二、质控

1. 原始数据质控：FastQC 查看 Phred 质量分布、接头的丰度（ATAC-seq 常见 Nextera 接头）

2. 去接头+修剪低质量碱基：Trim Galore（cutadapt），Nextera 转座酶接头需用其 specialized 处理模式

3. 过滤后复检：再次 FastQC 确认质量达标

三、比对（hg38）

1. Bowtie2 比对参数建议：--very-sensitive -X 2000（保留有效片段范围较宽，后续再筛选）

2. 过滤处理（关键步骤）：

• 保留比对质量 MAPQ ≥ 30
• 去除线粒体比对结果（chrM）
• 去重：Picard MarkDuplicates 或 samtools markdup（ATAC-seq PCR 重复常见，需统计比例）
• 仅保留配对比对成功的 read

3. Tn5 转位偏移校正：脚本 shift 分别处理正负链（+4 / -5 bp）

四、Call Peaks

1. 筛选片段大小：仅保留插入片段长度 < 2 kb（通常 split 成 <100bp、100–150bp、150–200bp 等，可分别分析核小体周期）

2. MACS2：macs2 callpeak -t bam -f BAMPE -g hs --nomodel --shift -37 --extsize 73 -q 0.01（或直接 BAMPE 模式）

3. 20 个样本可先逐个 call peak，再做一致性合并 peak 集（如 IDR 过滤或取并集）

五、质量评估

1. FRiP 评分

• 用 BEDTools 统计落在 peak 区域内的比对 reads 比例：bedtools multicov 或 featureCounts
• 公式：FRiP = peak 内 reads / 总过滤后 reads
• 经验参考：FRiP ≥ 0.25 为 ENCODE 认可标准；ATAC-seq 样本低于 0.1 需警惕
• 输出格式：| 样本 | FRiP | 是否达标 |

2. TSS 富集

• 用 deepTools：computeMatrix reference-point --referencePoint TSS（hg38 注释 GTF，如 GENCODE）→ plotHeatmap/plotProfile
• 或使用 ataqv / ENCODE pipeline 的 TSS enrichment score（以 TSS ±1kb 信号与背景比值衡量）
• 经验参考：TSS 富集 > 6–8 为质量良好，< 2 提示样本可能受损

六、其他建议质控指标

• 文库复杂度（PBC/NRF，可由 Picard 输出）
• 插入片段分布核小体周期（V/N/W 模式）
• 比对率、重复率汇总成 QC 报告表

七、交付物

• 每样本：过滤后 BAM、bigWig 轨道、peak 文件（narrowPeak）
• 汇总表：FRiP 评分、TSS 富集分数、比对率、重复率
• 可视化：TSS 热图/